0.01M的PBS配制方法：800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L，0.22um濾膜過濾后，室溫保存。

 

二、制備一個(gè)陰性對(duì)照來

 

    設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細(xì)胞（制備過程如下1-6）

 

三、若做DNA倍體分析，需另設(shè)附加對(duì)照

 

    管腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的混合管，比例至少為2：1

 

四、BD流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期/DNA分析實(shí)驗(yàn)步驟

 

1、將細(xì)胞消化后，用冷PBS洗細(xì)胞兩次，300g×5min（若細(xì)胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到500g），為減少細(xì)胞損失可用1.5ml離心管離心；

2、棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細(xì)胞團(tuán)，加入1mlBufferSolution并低速混勻細(xì)胞。

3、室溫離心，300g×5min；

4、重復(fù)2、3一次；

5、棄上清留大約50ul下面的液體，加入1mlBufferSolution重懸細(xì)胞；

6、計(jì)數(shù)細(xì)胞，用BufferSolution將細(xì)胞密度調(diào)為1×106個(gè)/ml；

7、染色：

A．取0.5ml含細(xì)胞5×105個(gè)；

B．每管加入250ulSolutionA，用手輕拍混勻（勿用漩渦混勻）；

C．室溫反應(yīng)10min，保留SolutionA；

D．加入200ulSolutionB，輕輕混勻；

E．室溫反應(yīng)10min，保留SolutionA+B；

F．加入200ul冷SolutionC，輕輕混勻，黑暗處2-8℃孵育10min；

用50um尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，加入上樣管上流式分析（3h內(nèi)分析完）。